通过人工干预提高细胞内miRNA的表达水平是miRNA研究最常用的技术手段。研究者可以通过转染miRNA类似物(miRNA mimic) 或pre-/pri-miRNA表达质粒以提高细胞内miRNA水平。研究表明,转染含有pre-miRNA及其两端侧翼序列(各100-200 bp)的pri-miRNA表达载体,能在最大程度上模拟miRNA在体内的合成过程,因此被众多研究者青睐。Geneup公司设计的miRNA过表达载体,分为组成型和诱导型两类。
(一)miRNA过表达载体
1. pLVc-200 (pLVc/CMV-EGFP.miRNA):miRNA组成型过表达载体
载体特征:
u 用CMV启动子驱动下游标记蛋白EGFP及miRNA的共表达;
u 共表达的EGFP可快速便捷地检测转染或感染效率;
u 既可用于瞬时转染,也可包装成慢病毒感染细胞;
u 与第四代慢病毒包装质粒匹配,可制备高滴度慢病毒颗粒;
u 含有嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选基因,可筛选稳定表达细胞系。
载体图谱:
2. pLVi-201 (pLVi/TRE3G-RFP.miRNA):miRNA诱导型过表达载体
载体特征:
u 将新一代四环素反应元件(TRE3G)和四环素激活因子(TetON3G)反向克隆到同一慢病毒载体,能显著提高诱导效果,并降低本底;
u 用红色荧光蛋白(RFP)作为报告基因,只有在添加强力霉素(DOX)情况下,RFP及其下游的miRNA才能共表达;
u 既可用于瞬时转染,也可包装成慢病毒感染细胞;
u 与第四代慢病毒包装质粒匹配,可制备高滴度慢病毒颗粒;
u 含有嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选基因,可筛选稳定表达细胞系。
载体图谱:
3. pLVi-202 (pLVi/TETO7-RFP.miRNA):miRNA诱导型过表达载体。
载体特征:
u 将第三代四环素反应元件(TETO7)和四环素激活因子(rtTA3)同向克隆在慢病毒载体;
u 用红色荧光蛋白(RFP)作为报告基因,只有在添加强力霉素(DOX)情况下,RFP及其下游miRNA才能共表达;
u 既可用于瞬时转染,也可包装成慢病毒感染细胞;
u 与第四代慢病毒包装质粒匹配,可制备高滴度慢病毒颗粒;
u 含有嘌呤霉素(Puromycin)抗性筛选基因,可筛选稳定表达细胞系。
载体图谱:
(二)、 miRNA表达文库 Geneup公司拥有由700多个最常见人源pri-miRNA过表达载体组成的miRNA表达文库。如果下表中没有您需要的miRNA,可以委托本公司定制。
(三)、 miRNA过表达慢病毒包装服务
慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体,可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,达到持久性表达的效果。慢病毒可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,具有广阔的应用前景。Geneup公司为您提供高质量的miRNA过表达慢病毒包装服务。
服务流程
客户提供:
1.若客户提供慢病毒载体质粒,需要提供载体的完整序列及相关信息;
2.需要测序鉴定载体时,必须提供相关的引物(测序通用引物除外);
3.若由本公司负责载体构建,客户需提供miRNA的名称,物种,miRbase登录号,基因模板;
4.如需筛选稳转细胞株,需要客户提供相应的细胞株;
5.说明是否需要鉴定miRNA的过表达情况。
本公司提供:
1.插入慢病毒载体中miRNA的测序报告及载体图谱;
2.通常提供10ml (>1×107 TU/ml)病毒原液,并附上一份QC报告;
3.对于需要通过慢病毒获得稳定细胞株的客户,我们将提供106数量的细胞,并附上一份QC报告;
4.如需鉴定过表达情况,我们将通过qRT-PCR方式提供miRNA的过表达情况;
5.如果需要大量病毒液用于动物实验,我们可提供1ml 滴度达109 TU/ml以上高度纯化的病毒液;
6.公司提供EGFP阳性对照病毒液(滴度约5×106 TU/ml),可按需选购。
产品订购信息:
服务内容 |
服务周期 |
慢病毒载体构建 |
15个工作日 |
慢病毒包装及滴度测定 >107TU/ml,10 ml |
15个工作日 |
慢病毒包装、浓缩及滴度测定>109TU/ml,1 ml |
30个工作日 |
筛选稳转细胞系(106细胞) |
15个工作日 |