Geneup公司利用两种荧光素酶报告基因检测系统,构建miRNA候选靶基因3`-UTR的载体,通过萤光素酶活性检测,确定miRNA与靶基因3`-UTR的关系。
1.单荧光素酶(F.Luc)报告载体pFLuc载体图谱:
载体特点:
Ø 用SV40启动子驱动萤火虫荧光素酶报告基因(F.Luc)的表达;
Ø 氨苄抗性筛选基因;
Ø 通过EcoRI- XbaI双酶切后插入3’-UTR。
检测原理:
将miRNA过表达载体或对照载体、及携带3`-UTR的pSL-UTR质粒和含有海肾萤光素酶报告基因(R.Luc)的内参载体(pRL-con-vector)共转染哺乳动物细胞,然后检测萤光素酶表达水平。相对于对照载体,如果miRNA过表达载体使萤火虫荧光素酶表达水平下降,说明miRNA能特异结合该3`-UTR,该基因可能为miRNA的靶基因。
2、双荧光素酶(F.Luc/R.Luc)报告基因载体:pdLuc
载体图谱:
载体特点:
Ø 用PGK启动子驱动萤火虫荧光素酶报告基因(F.Luc)的表达,同一载体上另一个报告基因是由SV40启动子控制下的海肾萤光素酶-新霉素基因融合蛋白基因(R.luc-Neo),用于归一化处理和阳性筛选;
Ø 可以用G418进行稳转细胞的筛选;
Ø 3`-UTR多克隆位点是EcoRI-XhoI
检测原理:
将miRNA过表达载体或对照载体、及携带3`-UTR的pdLuc-UTR质粒共转染哺乳动物细胞,然后检测萤光素酶表达水平。相对于对照载体,如果miRNA过表达载体使萤火虫荧光素酶表达水平下降,说明miRNA能特异结合该3’-UTR,该基因可能为miRNA的靶基因。
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